如何辨別倒置生物顯微鏡下的壞死細(xì)胞

    倒置生物顯微鏡多用來觀察和研究生物切片、細(xì)胞細(xì)菌以及活細(xì)胞組織培養(yǎng)、流質(zhì)沉淀等，同時也可以用來觀察其他透明或半透明物體以及粉末、細(xì)小顆粒等。在觀察細(xì)胞時，有些實驗要求用藥物來處理細(xì)胞，在不同藥物濃度下細(xì)胞可能壞死，也可能調(diào)亡。先介紹兩個概念：
    1）凋亡：凋亡是指細(xì)胞在一定生理和病理條件下，遵循自身程序，由基因調(diào)控的主動性死亡過程。因此，從活細(xì)胞凋亡到死亡有一定過程和有一定時間跨度的，根據(jù)凋亡的誘因不同，時間跨度從幾小時到幾天不等。凋亡過程中首先出現(xiàn)的是細(xì)胞膜的不對稱改變即PS的外翻和線粒體的膜電位的改變；隨后出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，細(xì)胞體積變小，變形，細(xì)胞膜的通透性改變和DNA的片段化；凋亡晚期細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落；zui后隨溶酶體裂解、蛋白酶的釋放激活，細(xì)胞崩解。因此，凋亡的一個動態(tài)的過程，隨時間的推移、誘導(dǎo)凋亡原因和檢測方法的不同，檢測和觀察結(jié)果也大不相同。
    2）壞死：活細(xì)胞在某些因素的作用下直接進(jìn)入死亡階段，從而很難和晚期凋亡相區(qū)別。
    那么在倒置熒光顯微鏡下如何辨別已經(jīng)壞死的細(xì)胞呢？
    我們采用Hoechst33342和碘化丙啶（PI）雙染的方法。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會固縮。Hoechst 33342可以穿透細(xì)胞膜，染色后凋亡細(xì)胞熒光會比正常細(xì)胞明顯增強。碘化丙啶（PI）不能穿透細(xì)胞膜，對于具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞不能染色。而對于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性喪失，碘化丙啶（PI）可以染色壞死細(xì)胞。上述兩種染料雙染后，使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測時，正常細(xì)胞為弱紅色熒光+弱藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞為弱紅色熒光+強藍(lán)色熒光，壞死細(xì)胞為強紅色熒光+強紅色熒光+強藍(lán)色熒光。這種凋亡和壞死鑒定的試劑盒在市場上也很常見。